luciferase_Luciferase流式细胞仪检测

1.蛋白质抑制基因表达，luciferase结果是什么样

2.双荧光素luc不表达

3.luciferase 质粒和gfp质粒哪个好

4.基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

5.绿色荧光蛋白的发现过程

6.绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用

7.什么是荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因？

报告基因检测被广泛应用于研究基因表达及外部刺激下原核和真核细胞的反应。Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。但是报告基因实验中往往会受到各种实验条件的影响，例如培养细胞的数目和活力的差别、细胞转染和裂解的效率、以及加样操作过程中引起的变异。Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统中含有在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶。共转染的“对照”报告基因会作为内对照，减小细胞活性和转染效率对实验的影响。因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。Promega提供了一种先进的双报告基因技术（Dual-reporter assays）,结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试，该技术同时使用两个独立的报告基因以提高实验的准确性，Biotek synergy 系列微孔板检测仪作为双报告基因的检测分析平台获得了Promega DLR 认证。

在双报告基因系统中，通常一个报告基因用于检测特定实验条件下待测物的反应，即“实验”reporter，另一个报告基因用来检测实验条件，类似于内部对照，用于校准“实验”reporter的数据。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，例如：转染效率、细胞活性、细胞裂解差异以及加样操作过程中引起的差异。Promega公司的Dual-Luciferase系统利用萤火虫和海肾荧光素酶的活性分别检测实验组和对照组。萤火虫荧光素酶是一种分子量为61KD的单体酶，分两步催化虫荧光素的氧化反应，产生560nm的光，海肾荧光素酶是一种分子量为36KD的单体酶，催化海肾荧光素的氧化反应，产生中心波长为480nm的蓝光。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶没有种源同源性，对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。

蛋白质抑制基因表达，luciferase结果是什么样

小动物活体成像主要用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术。生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，而荧光技术则用荧光报告基团（GFP、RFP，Cyt及dyes等）进行标记。

小动物活体成像技术是用高灵敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和图像处理软件，使得可以直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。

在拥有激发光多光谱分析功能的活体成像系统出现以前，科学家们被迫取各种方法来减少动物自发荧光，比如：用无荧光素鼠粮饲养小鼠、使用裸鼠等。

小动物活体荧光成像的组织放置的时间取决于多种因素，例如荧光探针和小动物品种等。一般来说，该技术允许研究人员对小鼠等小动物进行荧光活体成像研究约为1个小时，但是有时这种活体成像甚至可以持续几天。

双荧光素luc不表达

蛋白质抑制基因表达，luciferase结果是什么样

RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理

转录抑制

与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。

转录后抑制

不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。

翻译抑制

Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

luciferase 质粒和gfp质粒哪个好

双荧光素luc不表达有多种原因，实验过程中的每一个步骤都可能导致双荧光素luc不表达。

如果目的基因载体没有成功转移到受体细胞，或者受体细胞没有成活，以及实验过程中出现其他物质抑制了双荧光素luc的表达等等，都有可能导致双荧光素luc不表达。

基于荧光素酶（Luciferase）的发光原理，形成了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Fireflyluciferase）和海参荧光素酶（Renillaluciferase）。两者可与各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光值即表示两种酶的表达量多少。

基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

它们分别行使不同的功能～gfp表达绿色荧光蛋白～紫外激发下可见绿光～luciferase表达荧光素酶～需要特定底物反应后才能实现生物发光～gfp为激发荧光～luciferase发光为自然光～

绿色荧光蛋白的发现过程

基因表达调控主要实验技术有：ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase

1、 ChIP实验

通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。

2、 RIP实验

RIP技术（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

3 、RNA pull-down实验

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

4 、EMSA实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

5、 Luciferase实验

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。

萤光生成反应通常分为以下两步：

萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光

荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究、RNA剪接研究。

双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用）。

绿色荧光蛋白在细胞生物学中有哪些应用

1994年，华裔美国科学家钱永健（Roger Yonchien Tsien）开始改造GFP，有多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的**、蓝色，有的可激活、可变色。到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好，现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白，包括红色荧光蛋白。

生物发光现象，下村修和约翰森以前就有人研究。萤火虫发荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin），有化学反应如氧化，以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修和约翰森的研究。

下村修和约翰森用过几种实验动物，和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班要回家了，他把产物倒进水池里，临出门前关灯后，依依不舍地回头看了一眼水池，结果见水池闪闪发光。因为水池也接受养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响水母素，不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年，他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。

1955年Denport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因。在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈**、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。14年，他们纯化到了这个蛋白，当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光。这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET）在生物中的发现。

下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后，同事普腊石（Douglas Prasher）非常感兴趣发明生物示踪分子。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就很好应用，比用蛋白质方便多了。

普腊石1992年发表GFP的cDNA后，不做科学研究了。他申请美国国家科学基金时，评审者说没有蛋白质发光的先例，就是他找到了，也没什么价值。一气之下，他离开学术界去麻省空军国民卫队基地，给农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元，就可以做一个一般研究生都能做，但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内，比如细菌里，看到荧光，就完全证明GFP本身可以发光，无需其它底物或者分子。

将GFP表达到其它生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。

水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种，它需要荧光素。而GFP蛋白质本身发光，在原理上有重大突破。

Chalfie的文章立即引起轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。

纵观整个过程，从1961年到14年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少人注意。如果其他生化学家愿意，他们也可以得到水母素和GFP，技术并不特别难。在14年以后，特别是八十年代后，后继的工作，很多研究生都很容易做。其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色，并非显而易见。

什么是荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因？

绿色萤光蛋白(green fluorescent protein),简称GFP,这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现.其基因所产生的蛋白质,在蓝色波长范围的光线激发下,会发出绿色萤光.这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用.

由水母Aequorea victoria中发现的野生型绿色萤光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光绿光的范围下是较弱的位置.由海肾(sea pansy)所得的绿色萤光蛋白,仅有在498nm有一个较高的激发峰点.

在细胞生物学与分子生物学领域中,绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene).一些经修饰过的型式可作为生物探针,绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现,并拿来映证某种设的实验方法.

GFP的性质

GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强,特别在450～490nm蓝光波长下更稳定.

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等.

GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.

由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.

GFP在肿瘤发病机制研究中的应用

GFP 是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能.GFP 与目的基因融合,将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水平,显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化,为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件.

在肿瘤的形成过程中,增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体.若肿瘤细胞凋亡占优势,肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡.肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控.用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因,并与正常组织进行比较,则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因;反之,为促进肿瘤细胞凋亡的基因.

肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现,其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常.利用GFP 的示踪特性,研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系,即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制.

1994年,华裔美国科学家钱永健（Roger Y Tsien）开始改造GFP,有多项发现.世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种,有的荧光更强,有的**、蓝色,有的可激活、可变色.到一些不常用做研究模式的生物体内找有颜色的蛋白成为一些人的爱好,现象正如当年在嗜热生物中找到以后应用广泛的PCR用多聚酶后的一波浪潮.不过真发现的有用东西并不很多.成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现其他荧光蛋白,包括红色荧光蛋白.

生物发光现象,下村修和约翰森以前就有人研究.萤火虫发荧光,是由荧光酶（luciferase）作为酶催化底物分子荧光素（luciferin）,有化学反应如氧化,以后产生荧光.而蛋白质本身发光,无需底物,起源是下村修和约翰森的研究.

下村修和约翰森用过几种实验动物,和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母.1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道,他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素.据说下村修用水母提取发光蛋白时,有天下班要回家了,他把产物倒进水池里,临出门前关灯后,依依不舍地回头看了一眼水池,结果见水池闪闪发光.因为水池也接受养鱼缸的水,他怀疑是鱼缸成分影响水母素,不久他就确定钙离子增强水母素发光.1963年,他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系.其后Ridgway和Ashley 提出可以用水母素来检测钙浓度,创造了检测钙的新方法.钙离子是生物体内的重要信号分子,水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法,是目前仍用的方法之一.

1955年Denport和Nicol发现水母可以发绿光,但不知其因.在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中,有个注脚,说还发现了另一种蛋白,它在阳光下呈绿色、钨丝下呈**、紫外光下发强烈绿色.其后他们仔细研究了其发光特性.14年,他们纯化到了这个蛋白,当时称绿色蛋白、以后称绿色荧光蛋白GFP.Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移.水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光.这是物理化学中知道的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现.

下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣,也没有意识到应用的重要性.他离开普林斯顿到 Woods Hole海洋研究所后,同事普腊石(Douglas Prasher)非常感兴趣发明生物示踪分子.1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了水母素的基因（准确地说是cDNA）.1992年,普腊石拿到了GFP的基因.有了cDNA,一般生物学研究者就很好应用,比用蛋白质方便多了.

普腊石1992年发表GFP的cDNA后,不做科学研究了.他申请美国国家科学基金时,评审者说没有蛋白质发光的先例,就是他找到了,也没什么价值.一气之下,他离开学术界去麻省空军国民卫队基地,给农业部动植物服务部工作.当时他如果花几美元,就可以做一个一般研究生都能做,但是非常漂亮的工作：将水母的GFP基因放到其他生物体内,比如细菌里,看到荧光,就完全证明GFP本身可以发光,无需其它底物或者分子.

将GFP表达到其它生物体这项工作,1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室,和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji.

水母素和GFP都有重要的应用.但水母素仍是荧光酶的一种,它需要荧光素.而GFP蛋白质本身发光,在原理上有重大突破.

Chalfie的文章立即引起轰动,很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统.在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章,其实不过是跟风性质,没有原创性.

纵观整个过程,从1961年到14年,下村修和约翰森的研究遥遥领先,而很少人注意.如果其他生化学家愿意,他们也可以得到水母素和GFP,技术并不特别难.在14年以后,特别是八十年代后,后继的工作,很多研究生都很容易做.其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜色,并非显而易见.

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，具有检测灵敏度高，没有信号背景，并且不损害植物的优点。

来自维多利亚水母的绿色荧光蛋白（green：fluorescent：protein，GFP）是一种由238个氨基酸残基组成的单体蛋白，分子量27ku。它的特点是无需额外添加任何底物、酶、因子等物质，也没有种属、组织和位置特异性，该基因是目前惟一在细胞内稳定表达且检测简单，结果真实可靠的新型报告基因，只要暴露于395nm的远紫外光或490nm的蓝光下便可受激而发出绿色荧光（508nm）。

通过突变与重新合成，将水母的密码子换成植物偏爱的密码子，GFP基因在植物中的表达效率与稳定性提高。而且，含此修饰GFP基因的转基因植物不仅形态正常，而且完全可育。